兴奋性氨基酸加强高原低氧大鼠下丘脑前生长抑素原mRNA的表达

中国应用生理学杂志 2000年第4期第16卷 研究论文

作者：阮怀珍　范晓棠　张金海　袁碧波　吴喜贵

单位：第三军医大学神经生物学教研室，重庆　400038

关键词：低氧；前生长抑素原mRNA；谷氨酸；天门冬氨酸

　　摘要 目的和方法：应用大鼠高原低氧模型及原位杂交技术和氨基酸测定法，研究下丘 脑前生长抑素原(PPS)mRNA表达和谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)含量的变化。结 果： 高原低氧组大鼠下丘脑Glu和Asp的含量明显增多，室周核、室旁核、弓状核PPS-mRN A阳性神经元数目显著增加；而NMDA受体拮抗剂氯铵酮，虽然对Glu和Asp含量无明显影响， 但可使高原低氧大鼠下丘脑PPS-mRNA阳性神经元数目减少。结论：下丘脑生长 抑素可能参与了高原低氧反应，Glu通过NMDA受体可增强高原低氧大鼠下丘脑 pPS-mRNA的 表达。

　　中图分类号：　R345．44；R394．2　　　文献标识码：A

　　文章编号：1000-68 34(2000)04-0302-03

EXCITATORY AMINO ACID ENHANCE PREPRO-SOMATOSTATIN

　　mRNA EXPRESSION INDUCED BY ALTITUDE

　　HYPOXIA IN THE RAT HYPOTHALAMUS

RUAN Huai-zhen　FAN Xiao-tang　ZHANG Jin-hai　YUAN Bi-bo　WU Xi-gu i

　　（Department of Neurobiology,Third military medical University,Cho ngqing 400038）

　　ABSTRACT　Aim and Methods:Contents of glutamate (Glu),asparate (Asp) and expressio n of prepro-somatostatin mRNA (PPS-mRNA) in rat hypothalamus were measured by using imitated altitude hypoxia rat model, amino acid analyzer and in situ h ybri dization technique.Results: After rats were subjected to altitud e hypoxia,contents of Glu and Asp in hypothalamus and PPS-mRNA expression in pe riventricular nucleus (PeVN),paraventricular nucleus (PaVN) and arcuate nucleus (ArcN) were increased significiantly.Ketamine, a NMDA receptor antagonist,could decrease the number of PPS-mRNA neurons in rat hypothalamus evoked by altitude hypoxia, but had no effect on Glu and Asp contents evoled by altitude hypoxia.[ WTHZ Conclusion:It is suggested that somatostatin maybe paticipate in a ltitude hypoxia reaction,Glu can enhance PPS-mRNA expression through NMDA recep tor.

　　KEY WORDS:　hypoxia;　prepro-somatostatin mRNA;　glutamate;　aspartate

　　近十年的研究工作证明谷氨酸(glutamate，Glu)，天门 冬氨酸(aspartate，Asp)是中枢神经系统的兴奋性递质，它们在中枢神经系统发生过度活动 时可影响神经细胞的功能，甚至引起神经元的损伤^［1］。生长抑素(somatostatin， SOM)不仅是下丘脑分泌的一种调节性多肽，而且是一种作用广泛、功效很强的神经递质或神 经调节物，它参与了机体多种生理功能的活动和调节。但是在高原低氧环境中，下丘脑兴奋 性氨基酸与SOM的变化及关系，尚不清楚。本文应用原位杂交技术和氨基酸测定法研究了高 原低氧大鼠下丘脑内前生长抑素原 mRNA(prepro-somatostatin mRNA，PPS-mRNA)的表达 和Glu、Asp含量的变化。

　　1　材料与方法

　　1．1　动物模型及分组

　　实验用 Wistar大鼠66只，体重为150～200 g，雌雄不拘。随机分为正常对照组(室温常 氧)、氯铵酮组(Ketamine，腹腔注射40 mg／kg，6 h，室温常氧)、低氧1，7 d组(将大鼠置 于模拟海拔6 000 m的低压舱内，舱内温度为4℃，6 h／d)及氯铵酮+低氧1，7d组。每组 11只，5只进行原位杂交染色，6只进行氨基酸含量测定。

　　1．2　谷氨酸和天门冬氨酸的提取及测定

　　大鼠断头，迅速取出下丘脑，精确称重。置样品于冰镇玻管中，加入10％磺基水杨酸( 1　ml)，冰浴下以玻璃匀浆器手动匀浆并离心(4℃，15 000r/min,30 min)，取上清液50 μl ，用美国Beckman-6300黄金系列高效氨基酸分析仪检测Glu和Asp的含量。分析条件如下： 柱高10 cm，柱温33℃，锂缓冲液(Li-A)，茚三酮的流速为10 ml/h，比色波长为570 nm 。

　　1．3　前生长抑素原mRNA原位杂交法

　　实验毕，按常规进行大鼠脑组织灌流，固定，取出下丘脑，行冠状连续切片(35　μm) ，然后以地高辛标记的反义 cRNA探针(400 bp)按文献^［2］叙述步骤进行原位杂交前 、杂交和杂交后处理(杂交过程中的温度是恒度的，不需要调节)。抗地高辛抗体工作浓度为 1∶1 000，以NBT／BCIP(400 μg／ml／200　μg／ml)反应液显色。对照实验包括用2 μg/ mg RNA酶A预处理切片30 min和用不含探针杂交缓冲液杂交，结果均检测不到明显的杂交信 号。在每一动物下丘脑不同核团随机抽样4片，经图像分析仪，作阳性细胞计数(整个核团) ，取均数作为该动物的 PPS-mRNA数。

　　1．4　数据处理

　　数据以均数±标准差(±s)表示，用电子计算机经双样本t检验程序(PD A-2)进行处理。

　　2　结果

　　2．1　高原低氧对大鼠下丘脑Glu和Asp含量的影响

　　下丘脑Glu和 Asp的含量在低氧第 1 d和7 d均明显多于对照组。每天进舱前腹腔注射 NMDA受体拮抗剂氯铵酮(40 mg／kg)，观察到与同一时间单纯低氧组比较，大鼠下丘脑Glu和A sp含量变化不大，而单纯氯铵酮组，下丘脑Glu和Asp的含量与对照组比较无明显差异(表1) 。

Tab.1 Effects of altitude hypoxia on content of Glu and

　　Asp in rat hypothalamus (μmol/g^．w,±s,n=6)

　　^*　P＜0.05,^**　P＜0.01 compared with control2.2　高原低氧对大鼠下丘脑PPS-mRNA的影响

　　大鼠下丘脑室周核( periventricular　nucleua，PeVN)，室旁核(paraventricular n ucleus，PaVN)，弓状核(arcuate nuxleus，ArcN) PPS-mRNA阳性神经元数目在低氧的第1 d即开始增加，7 d仍很明显(表2；图 a，b)。每天进舱前腹腔注射NMDA受体的拮抗剂氯铵酮 (40 mg／kg)，观察到与同一时间单纯低氧组比较，大鼠下丘脑PPS-mRNA阳性神经元数目显 著减少(P＜0．01，表2；图c)。而单纯氯铵酮组、下丘脑 pPS-mRNA阳性神经元数目与 对照组比较无明显差异。

Tab.2 Effects of altitude hypoxia on number of PPS-mRNA

　　neurons in rat hypothalamus(±s,n=5)

　　^**　P＜0.01,vs control；^##　P＜0 .01,vs hypoxia 1 d ^△△P＜0.01,vs hypoxia 7d

Fig.1 Photomicrograph of PPS-mRNA neurons in the rat hypo thalamus

　　a:PPS-mRNA neurons in periventricular nucleus

　　were very sparse in control group(×100).

　　b:After altitude hypoxia exposure,PPS-mRNA neurons in

　　periventricular nucleus w ere densely labled (7 d,×100).

　　c:With ip Ketamine,PPS-mRNA neurons in periventricular nucleus

　　were decreased a fter altitude hypoxia exposure (7 d,×100)

　　3　讨论

　　低氧及缺氧缺血可致中枢神经系统神经递质代谢紊乱，使脑内兴奋性氨基酸增多^{［ 3］}。本文应用高原低氧模型，观察到下丘脑Glu、Asp含量显著提高。低氧时细胞膜的兴 奋性增加，膜发生去极化，大量的兴奋性氨基酸递质释放入突触间隙，这可能是低氧致兴奋 性氨基酸含量升高的主要机制。

　　SOM是一种作用广泛、功效很强的神经递质或神经调节物，它参与了机体多种生理功能 的活动和调节。实验发现，大鼠下丘脑正中隆起的 SOM受各种应激刺激而发生快速反应性释 放增加，这些反应是通过“快”神经递质介导的。Glu和Asp是中枢神经系统的主要兴奋性神 经递质。形态学研究表明，大量谷氨酸脱羧酶免疫阳性纤维位于下丘脑的后部和正中隆起， 并发现了 Glu和NMDA连接点^［4］，在结区大量的Glu与室旁核，视上核的神经内 分泌神经元构成了突触连接^［5］这些解剖的联系支持兴奋性氨基酸与 SOM必然存在 功能上的联系。通过离体和在体实验证实，Glu可通过 NMDA受体来调节 SOM的释放^{［6 ］}，NMDA可以引起下丘脑神经元细胞内 SOM含量增加及 PPS-mRNA水平的升高^［7］ 。在下丘脑神经元的培养中发现，孵育介质中 Glu的大量释放可导致 SOM的大量释放，NM DA受体的特异拮抗剂可完全阻滞 Picrotoxin引起的 SOM的释放。氯铵酮是离子型NMDA受体 拮抗剂，可通过抑制 NMDA受体的过度刺激，调节细胞内Ca²⁺的浓度，减轻神经元的 损伤^［8］。我们在实验中观察到高原低氧可使大鼠下丘脑 SOM阳性神经元增多，而 氯铵酮虽然不影响高原低氧引起的大鼠下丘脑Glu和Asp含量增多，但由于阻断了NMDA受体， 使Glu对SOM的兴奋作用减弱，故下丘脑PPS-mRNA阳性神经元数目减少，这进一步证实了 G lu是通过NMDA受体来刺激 PPS-mRNA的表达。下丘脑对低氧较为敏感，在低氧状态下，下丘 脑兴奋性氨基酸发生变化，进而影响SOM的释放和表达。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39670283)

　　作者简介：阮怀珍（1961-），女，安徽合肥人，教授，博士，从事 神经生理学研究。

　　4　参考文献

　　［1］　Kimura M,Sawada K,Miyagawa T,et al.Role of glutamate recepto rs and voltage-dependent calcium and sodium channels in the extracellular gluta mate/aspartate accumulation and subsequent neuronal injury induced by oxygen/glu cose deprivation in cultured hippocampal neurons［J］.J Pharmacol Exp Ther,1 998,285(1):178-185.

　　［2］ 阮怀珍,李希成,蔡文琴.P物质及福尔马林增强前生长抑素原mRNA 在大鼠脊髓的表达 ［J］.中国神经学杂志，1998，14(2)：105-108.

　　［3］ Krajnc D,Neff N H,Hadjiconstantinou M.Glutamate,glutamine and glutamine s ynthetase in the neonatal rat brain following hypoxia［J］.Brain Res,1996,707(1 ):134-137.

　　［4］ Fagg G E,Foster A C.Amino acid neurotransmitters and their pathways in th e mammalian central nervous system［J］.Neuroscience,1983,9(4):701-719.

　　［5］ Van den pol A N,Wnarin J P,Dudek F E. Glutamate,the dominant excitatory t ransmitter in neuroendocrine regulation［J］.Science,1990,250:1276-1278.

　　［6］ Joanny P,Steinberg J,Oliver C,et al.Effect of excitatory amino acids o n rat hypothalamic somatostatin secretion in vitro［J］.Peptides,1997,18(7):103 9-43.

　　［7］ Rage F,Benyessi A,Arancibia S,et al.Stimulatory effect of N-methyl- D-asparate on somatostation gene expression in cultured hypothalamic neurons［J ］.Molecular brain Res,1993,17:287-294.

　　［8］ Pfenninger E,Himmelseher S.Neuroprotection by ketamine at the cellular le vel［J］.Anaesthesist,1997,46(Suppl)1:S47-54.

收稿日期：1999-03-08

　　修回日期：2000 -01-10

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